tp://www.google.com/
آزمايشي در فضاي تعليق
معرفي دستگاه الکتروفورز
الکتروفورز از شناخته شده ترين روش هاي آزمايشگاهي براي جداسازي بيومولکول ها است.
اين روش در سال ۱۸۰۷ توسط Reuss کشف شد. او مشاهده کرد که ذرات خاک رس تحت
تاثير ميدان الکتريکي در آب پراکنده مي شوند. به طور کلي الکتروفورز حرکت ذرات
پراکنده در داخل مايعي تحت تاثير يک ميدان الکتريکي يکنواخت است. همين حرکت در
فضايي با ميدان الکتريکي غير يکنواخت دي الکتروفورز ناميده مي شود.
الکتروفورز بدين دليل اتفاق مي افتد که ذرات معلق در مايع معمولا داراي بار
الکتريکي سطحي هستند و ميدان الکتريکي نيروي کولوني الکترواستاتيک به اين ذرات
باردار اعمال مي کند. اخيرا شبيه سازي هاي ديناميک مولکولي، نظريه اي بيان داشته
اند مبني بر اينکه براي انجام الکتروفورز حتما نبايد ذرات بار سطحي داشته باشند و
حتي ذرات خنثي نيز به علت ساختار مولکولي خاصي که آب به عنوان مايع واسط دارد، مي
توانند الکتروفورز شوند.
نيروي کولوني الکترواستاتيک اعمال شده به بار سطحي، با نيروهاي مخالف
الکترواستاتيک کاهش پيدا مي کند. بر طبق تئوري لايه مضاعف، تمام سطوح بار دار در
مايعات با لايه اي از بار مخالف پوشانده مي شوند که از نظر مقداري کاملا برابر با
بار سطحي است اما با علامت مخالف آن. ميدان الکتريکي همانند بار سطحي به اين لايه
نيرو وارد مي کند. مجموع اين نيروها برابر است با اولين نيروي نامبرده، اما در جهت
مخالف آن. در حقيقت اين نيرو به يون هاي موجود در لايه ثانويه اعمال مي شود. اين
يون ها در فاصله اي از سطح ذره قرار مي گيرند و بخشي از اين نيروي الکترواستاتيک
را از طريق تنش برش سيال به سطح ذره منتقل مي کنند اين بخش از نيرو که به بدنه ذره
وارد مي شود، نيروي منفي الکتروفورتيک ناميده مي شود.
يک نيروي الکتريکي ديگر نيز وجود دارد که مرتبط با انحراف لايه ثانويه است و مربوط
به تقارن کروي و رسانايي سطح است و به سبب زيادي يون ها در لايه ثانويه به وجود مي
آيد. اين نيرو نيروي تخفيف الکتروفورتيک ناميده مي شود.
تمام اين نيروها با اصطکاک هيدروديناميک، به تعادل مي رسند و باعث حرکت ذرات در
سيال مي شود. سرعت اين حرکت v،
متناسب با شدت ميدان الکتريکي E
است (البته در صورتي که اين ميدان خيلي قوي نباشد.) ضريب اين تناسب تحرک پذيري
الکتروفورتيک است که رابطه بين شدت ميدان الکتريکي و سرعت ذره را مشخص مي نمايد:
ماکرومولکول هايي مانند اسيد نوکلئيک، DNA
و پروتئين ها نيز باردار هستند و مي توان با قرار دادن آن ها در يک ميدان
الکتريکي، بر مبناي خاصيت الکتروفورز آن ها را تفکيک کرد. سرعت حرکت مولکول ها در
اين شرايط نه تنها تحت تاثير بار الکتريکي و شدت ميدان الکتريکي است، بلکه عواملي
نظير اندازه، وزن مولکولي و شکل فضايي مولکول نيز در اين امر دخيل هستند. همچنين
اثرات محيطي نظير نوع و نحوه استفاده از بافرها و حرارت ايجاد شده در حين کار نيز
از عوامل موثر بر جداسازي مولکول هاي نمونه هستند. معمولا الکتروفورز براي تفکيک
مولکول هاي بزرگي چون پروتئين ها و اسيدهاي نوکلئيک به کار برده مي شود، اما در
مواردي نيز براي جداسازي مولکول هاي باردار کوچک تر نظير قندها، اسيدهاي آمينه،
پپتيدها و حتي يون هاي ساده مورد استفاده قرار مي گيرد.
در طي قرن ۲۰ ميلادي چندين تئوري براي محاسبه اين پارامتر به
وجود آمده اند. که مهم ترين آن ها نظريه Smoluchowski
در سال ۱۹۰۳ ميلادي بود.
Arne Tiselius در سال ۱۹۴۸ به خاطر زحماتي که
براي الکتروفورز و آناليز جذبي کشيد برنده جايزه نوبل شد و از اين رو او را پدر
الکتروفورز ناميدند. اولين الکتروفورز نيز الکتروفورز بدون مرز تيسليوس نام داشت
که به وسيله آن محلول هاي پروتئيني غليظ را در يک تيوب U
شکل بزرگ که به وسيله بافر پوشانده شده بود، مورد آزمايش قرار مي دادند. اين روش
الکتروفورز بسيار مشکل بود، به همين دليل در سال ۱۹۵۰ تغييراتي در عملکرد آن
اعمال شد. ابتدا از فيلترهاي کاغذي و استات سلولز استفاده مي شد، اما به دليل
ظرفيت محدود و رزولوشن پايين اين مواد، جاي خود را به ژل دادند. ژل هاي استفاده
شده در آن زمان به علت بزرگ بودن خلل و فرج ها قادر نبودند پروتئين ها را به تفکيک
سايز جداسازي کنند، از اين رو به تدريج به ژل هايي چون آگاروز دست يافتند.
امروزه الکتروفورز ژلي از بخش هاي جدا ناپذير هر تحقيق و فعاليت هاي آزمايشگاهي به
منظور جداسازي ماکرومولکول هااست. محدوده وسيعي از فعاليت هاي آزمايشگاهي تحقيقاتي
و کلينيکي مانند تسلسل ژن ها، جداسازي کروموزوم ها، جداسازي و تعيين خصوصيات
پروتئين ها توسط اين روش انجام مي گيرد. علاوه بر اين، استفاده از الکتروفورز از
مرز آزمايشگاه ها فراتر رفته و به عنوان شاهدي براي وکلا، قضات و هيات منصفه در
امور قضايي محسوب مي شود. تشخيص هويت DNA به خصوص در موارد تعويض نوزاد در بيمارستان ها و تعيين والدين فرد
کاربرد بسياري در علوم ژنتيک پيدا کرده است.
در حال حاضر آگاروز و پلي کريل آميد متداول ترين و پر کاربردترين ماده به عنوان
واسط در الکتروفورز ژلي محسوب مي شوند. در اغلب دستگاه هاي الکتروفورز، ژل مابين
دو محفظه بافري قرار مي گيرد به طوري که ژل تنها واسطه در عبور جريان الکتريسيته
بين اين دو محفظه باشد. هر دو شبکه خلل و فرج داري توليد مي کنند که ميکرومولکول
هايي بارداري را که در پاسخ به ميدان الکتريکي جابه جا مي شوند در خود جاي مي
دهند. به عنوان مثال زماني که جريان اعمال مي شود، DNA هاي با بار منفي به سمت الکترودهاي باردار
مثبت حرکت مي کنند. خلل و فرج هاي موجود در شبکه ژلي انتقال مولکول هاي بزرگ را
محدود مي کنند و اين در حالي است که مولکول هاي کوچک تر با آزادي بيشتري منتقل مي
شوند و در فاصله دورتري از الکترودها قرار مي گيرند. اين غربال مولکولي مولکول ها
را بر مبناي سايزشان جدا مي کند. همچنين مي توان مولکول ها را بر مبناي بار اوليه
اي که داشتند جداسازي کرد. مولکول هايي که بار بيشتري دارند تحرک الکتروفورزي
بيشتري از خود نشان مي دهند و سريع تر منتقل مي شوند بدين ترتيب درون ژل با اولويت
باري که داشتند قرار مي گيرند. جداسازي بر مبناي بار به ژلي نياز دارد که مانند
آگاروز داراي خلل و فرج هاي بزرگ تري باشند. آگاروز براي جداسازي اسيد نوکلئيک ها
و پروتئين هاي خيلي بزرگ يا ترکيب ها استفاده مي شود. آگاروز يک پلي ساکاريد طبيعي
است که از نوع خاصي جلبک دريايي قرمز به دست مي آيد. زماني که گرما داده شده و سپس
سرد مي شود به صورت جامد متخلخلي با خلل و فرج هاي نسبتا بزرگ تبديل مي شود.
الکتروفورز ژل آگاروز (AGE)
را مي توان براي جداسازي مولکول ها بر مبناي بار يا وزن مولکولي شان استفاده کرد.
يکي از مهم ترين کاربردهاي AGE
جداسازي بخش هاي حاصل از برش DNA
با آنزيم هاي محدودکننده است.
در طي انجام الکتروفورز ثابت نگاه داشتن حرارت اهميت بسياري دارد چرا که به حفظ
تکرار پذيري آزمايش کمک مي کند. به عنوان مثال پليمريزه شدن آکريل آميد يک واکنش
گرمازا است و گرماي حاصله به خصوص در مورد ژل هاي غليظ تر، ممکن است باعث بروز بي
نظمي در اندازه ي منافذ ژل شود. انتقال گرما معمولا مشکلي در ژل هايي با غلظت کمتر
از %۱۵ T
ايجاد نمي کند. البته ممکن است بالا رفتن دما مشکلات ديگري چون شکستن شيشه هاي الکتروفورز
و آسيب به دستگاه را منجر شود. پروتئين ها به علت خصوصيت آمفوتري خود تحت تاثير pH محيط بارالکتريکي خاص خود را نشان مي دهند.
بدين علت در جداسازي توسط الکتروفورز بايد pH
محلول هاي مورد استفاده ثابت باقي بماند. از آنجا که الکتروليز آب در آند يون اي
"H+" و در کاتود يون هاي "OH " ايجاد مي کند، براي ثابت نگاه داشتن pH محلول هاي مورد استفاده، بايد آن ها را بافر
کرد.
نوع ديگري از الکتروفورز، الکتروفورز مويين (CE) است. اين تکنيک که عمده ترين کاربرد آن در
شيمي دارويي و درماني است، براي جداسازي مولکول هاي درشت و ريز در مجاري بسيار
نازک (با قطر داخلي ۲۰۰ ۲۰ميکرومتر) استفاده مي
شود. در اين روش، جداسازي با ولتاژ بالا kV) ۳۰ ۱۰) امکان پذير مي شود. از محاسن CE مي توان به سرعت دستيابي به نتيجه در آناليز
يون ها اشاره کرد. به طور کلي CE
بيشتر زماني مطرح مي شود که با آناليت هاي باردار با پلاريته و قطبيت زياد سر و
کار داريم. اين تکنولوژي در علوم بايوتکنولوژي جايگاه ويژه اي پيدا کرده و در
آناليز ماکرومولکول هايي چون پروتئين ها و کربوهيدرات ها جايگزين خوبي براي
الکتروفورز سنتي به شمار مي رود. همچنين تکنولوژي CE براي سرعت بخشي به رشد علم ژنتيک به خدمت
گرفته شده است. استفاده از الکتروفورز موئين در علوم تحليلي به خصوص در زمينه
دارويي و زهر شناسي رشد بسياري داشته است.
الکتروفورز موئين در بر گيرنده چندين تکنيک است که عملکرد و مشخصه هاي متفاوتي با
هم دارند. اين تکنيک ها که به مودهاي الکتروفورز موئين معروف هستند عبارتند از:
الکتروفورز ناحيه اي موئين (CZE)
، تمرکز ايزوالکتريک (IEF)،
الکتروفورز موئين ژلي، ايزوتاکوفورز (ITP)
و کروماتوگرافي الکتروسينتيک موئين.
نوع ديگري از الکتروفورز که قديمي ترين نوع اين تکنيک محسوب مي شود، الکتروفورز
سطحي نام دارد. در اين روش از يک لايه کاغذي متخلخلي با طول ۱۰
۲۰
سانتيمتر، ترموپلاستيکي متشکل از سلولز و اسيد استيک و ژل پليمر استفاده مي شود.
تشخيص هويت DNA
به وسيله الکتروفورز، اندازه گيري هر رشته و شمارش تعداد بخش ها و برش هاي تکرار
شده در آن است. دانشمندان براي اين کار از روش الکتروفورز ژلي استفاده مي کنند.
بدين ترتيب که با جريان الکتريکي رشته هاي DNA
را از ميان ژل عبور مي دهند. چون هر بيت از DNA داراي بار منفي است و در معرض نيروي
الکتريکي با بار برابر قرار مي گيرد و آن را به سمت وجهي از ژل که بار مثبت دارد،
پيش مي برد. ذرات کوچک تر سريع تر حرکت مي کنند. وقتي جريان برداشته مي شود، از ژل
تصويري گرفته مي شود تا مشخص شود هر بيت چه قدر جابه جا شده است. با مقايسه
باندهاي ايجاد شده با نمونه هاي استاندارد که سايزهاي شناخته شده اي دارند، طول هر
بخش از DNA به دقت اندازه گيري مي شود.
منابع :
----------------------
نویسنده: مهندس شادی نقدی
ماهنامه تخصصي مهندسي پزشکي ( www.iranbmemag.com
)
----------------------
+ نوشته شده در دوشنبه دوازدهم فروردین ۱۳۹۲ساعت 17:5 توسط جواد طائی
|
